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2011年药物分析辅导:酶的纯化

来源:网络 2011年7月25日
导读: 一个典型的酶纯化过程常包括多个单元操作,各单元操作如何串联,需靠实践摸索。

  酶是蛋白质,因此凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化,如盐析法、聚乙二醇沉淀法、有机浴剂分级沉淀法、等电点法、选择性沉淀法、各种柱层析法(吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤)、各种电泳法及亲和层析等。不同之处是酶的纯化过程尚需选用迅速简便的活力测定方法,以追踪酶的去向。在选用酶的活力测定方法时,分析方法的迅速要比其度更为重要。如宁可要一个需时5min,准确度为5%的方法;也不要一个需时30min,准确度为0.5%的方法。在建立活力测定法之后,再根据各单元纯化步骤及活力分布情况用列表形式表达,表的内容包括:操作步骤、总体积、酶浓度(每毫升酶活力)、总活力、蛋白质浓度mg/ml)、比活力(即纯度、酶活力单位/毫克蛋白)、产率%(每步总活力除以步的总活力)和纯化倍数(每步比活力除以步比活力)。

  一个典型的酶纯化过程常包括多个单元操作,各单元操作如何串联,需靠实践摸索。每经过一个步骤一般可提高酶纯度2一3倍,总纯度可提高数千倍,而总产率常仅百分之几或十几。总的原则是选用少的步骤而能取得的纯化效果、因为增加步骤势必增加酶的丢失。通常对于含盐浓度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用盐析法;对于低离子强度的酶溶液则可用吸附法或离子交换法。交替使用不同分级沉淀法常比单独重复同一类型方法更能奏效。所以常将吸附法、盐折法和有机溶剂分级沉淀法串联起来进行纯化。当这些方法仍达不到要求时,还可以采用一些包括电泳、层析法在内的其他类型纯化方法。

  当酶达到一定纯度时,便可以进行结晶,结晶也是纯化酶的有效手段之一。但应注意的是药用酶有些并不需要结晶。酶的次结晶纯度有时仍低于50%。酶的结晶通常可以在较纯的酶液中添加硫酸铵、氯化钠等盐达到一定饱和度,使酶慢慢结晶出来。此时必须控制温度和pH值。盐浓度要逐渐提高,添加速度要慢,才能得到较好的结晶。有时在低温下,用丙酮、乙醇等有机溶剂进行结晶。近年来采用平衡透析法,即将酶液装人透析袋中,置于一定饱和度的盐溶液中进行透折,这种操作可以获得大量结晶。

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